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分子生物学第 5 章第 4 节：蛋白质及 RNA 相互作用技术

#分子生物学 #实验技术 #蛋白质 #RNA #互作 #杂交 #染色质 #RNAi

IMPORTANT

主要内容

本文为第五章第四节“蛋白质及RNA相互作用技术”，详述酵母单/双杂交系统（DNA-蛋白/蛋白-蛋白互作）、免疫共沉淀（CoIP/GST沉降）、荧光共振能量转移（FRET活体检测）及染色质免疫共沉淀（ChIP定位DNA结合序列），并概述RNAi技术（siRNA介导基因沉默）的原理与应用。

知识点

酵母杂交：单杂交（DNA-蛋白）、双杂交（蛋白-蛋白；BD/AD结构域互补激活报告基因）。
CoIP技术：抗体-抗原复合物沉淀；GST标签纯化互作蛋白。
ChIP技术：甲醛交联固定DNA-蛋白→超声片段化→抗体富集靶序列→测序定位结合位点。
RNAi机制：siRNA-RISC复合体降解同源mRNA，实现基因敲低。

评级

难度：🌿🌿🌿🌿🌿
重要性：🌟🌟

AI 辅助说明： 本页摘要由 DeepSeek 辅助生成，需由作者核对；此说明不等同于科学审校记录。

5.4.1 酵母单杂交系统

yeast one-hybrid system
可识别稳定结合于 DNA 上的蛋白质，可在酵母细胞内研究真核生物中 DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选 DNA 文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因
基本原理：
1. 将已知的特定顺式作用元件构建到最基本密码子 （minimal promoter，Pmin） 的上游，把报告基因连接到 $P_{m i n}$ 下游
2. 将编码待测转录因子 cDNA 与已知酵母转录激活结构域AD融合表达载体导入酵母细胞
3. 该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活 $P_{m i n}$ 启动子，使报告基因得到表达
应用：确定某个 DNA 分子与某个蛋白质之间是否存在相互作用，用于分离编码结合于特定顺式作用元件或其他 DNA 位点的功能蛋白编码基因，验证转录因子的 DNA 结合结构域，准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序列

5.4.2 酵母双杂交系统

yeast two-hybrid system
一种利用酵母在体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的系统
转录因子 = DNA 结合结构域BD + 转录激活结构域AD

5.4.3 蛋白质相互作用技术

① 等离子表面共振SPR技术

蛋白质相互作用 → 共振角度改变
蛋白质浓度 $\propto$ 共振角度改变

② 免疫共沉淀技术（co-immuno precipitation，CoIP）

蛋白质相互作用 → 复合物沉淀

③ GST 及 GAD 融合蛋白沉降技术

体外实验

GST：谷胱甘肽 S-转移酶（一种标签）
GAD：谷氨酸脱羧酶

该技术利用 GST 对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球株的亲和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用蛋白
应用：
- 确定探针蛋白与未知蛋白间的相互作用
- 确证探针蛋白与某个已知蛋白质之间的相互作用

④ 荧光共振能量转移FRET

体内实验
检测活细胞内两种蛋白质分子是否直接相互作用

5.4.4 染色质免疫共沉淀技术

chromatin immuno precipitation，ChIP
实验步骤：
1. 在活细胞状态下固定蛋白质-DNA 复合物，并通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度的染色质小片段
2. 通过抗原抗体特异性识别反应，沉淀该复合物，从而富集与目的蛋白相结合的 DNA 片段
3. 对目的片段进行纯化和测序分析，就能获知与目的蛋白发生相互作用的 DNA 序列信息（包括 DNA 序列特征、在基因组上的位置、结合强度、对基因表达的影响等）

5.4.5 RNAi

RNA interfering
利用 siRNA 高效、特异性地降解细胞内同源 mRNA，从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型

TIP

٩(๑˃̵ᴗ˂̵๑)۶ 学累了记得好好歇歇捏~

分子生物学 第 5 章 第 4 节：蛋白质及 RNA 相互作用技术 ​

主要内容 ​

知识点 ​

评级 ​

5.4.1 酵母单杂交系统 ​

5.4.2 酵母双杂交系统 ​

5.4.3 蛋白质相互作用技术 ​

① 等离子表面共振SPR技术 ​

② 免疫共沉淀技术 （co-immuno precipitation，CoIP） ​

③ GST 及 GAD 融合蛋白沉降技术 ​

④ 荧光共振能量转移FRET ​

5.4.4 染色质免疫共沉淀技术 ​

5.4.5 RNAi ​