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BC 1-7 研究蛋白质的技术

#生物化学 #蛋白质 #氨基酸 #实验技术 #超滤 #电泳 #分析 #结构 #多肽

蛋白质制备注意事项

1. 避免过激因素
2. 低温操作
3. 尽可能使蛋白质浓度维持在较高水平

1. 蛋白质的分离与纯化

1.1 一般策略

1. 前处理
2. 粗分离
3. 细分离

1.2 分离方法

• 按分子大小
  • 透析和超过滤
  • 密度梯度离心
  • 凝胶过滤
• 按溶解度
  • 等电点沉淀
  • 盐析和盐溶
  • 有机溶剂分级分离法
  • 温度沉淀
• 按电荷
  • 电泳离子交换层析
  • 等电聚焦
  • 层析聚焦
• 吸附
  • 吸附层析
• 特异性亲和力
  • 亲和层析
• 其他
  • 高效液相色谱 HPLC
  • 快速蛋白液相层析 FPLC

1.3 按分子量大小与形状差异分离的方法

1. 透析和超过滤

• 透析：蛋白质不能通过半透膜，而水和无机盐等小分子能自由同故宫，可以将蛋白质与小分子物质分开
• 超过滤：利用外加压或离心使水和其他组分通过半透膜，蛋白质留在膜上

超过滤的应用

• 浓缩
• 梯度分离
• 脱盐/纯化

2. 密度梯度离心（超速离心） 蛋白质的大小与密度决定其沉降的位置

• 质量大、密度大的沉降快
• 蛋白质、RNA 多用蔗糖密度梯度，DNA 多用 CsCl 密度梯度

3. 凝胶过滤 利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法

分子筛原理

分子筛依靠其规整、均匀的微孔孔道，按分子大小和形状进行筛分：小于孔径的分子可进入孔道，大于孔径的分子被阻挡在外

[!QUESTION] 用盐析法提取蛋白质后，经凝胶层析，大分子蛋白质与小分子盐类，哪个先洗脱 答：蛋白质先洗脱出来

• Kd 值：分配系数，Kd = （洗脱体积 - 外水体积）/内水体积
• 外水体积：凝胶颗粒之间的外部间隙液体体积（排组体积）
• 内水体积：凝胶颗粒内部孔道中所含的液体体积
• 渗入限：凝胶孔道可完全渗入的最小分子量界限。小于渗入限的小分子可完全进入孔内，Kd = 1
• 排阻限：凝胶能允许进入孔道的最大分子量。大于排阻限的分子完全不能进入孔内，Kd = 0

凝胶的选择

1. 考虑凝胶性质，包括凝胶的分离范围（渗入限与排阻限）、理化稳定性、强度、非特异性吸附性质等
2. 考虑分离目的和样品的性质
3. 选择凝胶时，应使大分子组的分子量大于其排阻限（大分子 Kd = 0），而小分子分子量小于渗入限（小分子 Kd = 1）

凝胶洗脱策略

1. 整个洗脱过程保持一定操作压
2. 流速不宜过快，要稳定
3. 洗脱液成分不应改变
4. 多数情况可用水洗脱，但为了防止非特异性吸附，避免一些蛋白在纯水中难以溶解，以及蛋白质稳定性等问题，常采用缓冲盐溶液进行洗脱（离子浓度至少 0.02 M）
5. 洗脱用盐等介质要容易去除，对于吸附性强的物质也可采用水和有机溶剂的混合物进行洗脱

1.3 按溶解度分离的方法

1. 等电点沉淀和 pH 控制 处于 pI 的蛋白质溶解度最低，可在 pI 沉淀蛋白质以分离

2. 有机溶剂分级分离法 利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中溶解度不同而使蛋白质分离的方法，分辨率比盐析方法高，提纯效果好

3. 选择性沉淀法 选择一定的条件使其他蛋白质变性沉淀而不影响目标蛋白质的分离方法

4. 盐析与盐溶

• 盐析：低浓度的中性盐在蛋白质分子表面形成双电层使蛋白质溶解度增加
• 盐析：高浓度的中性盐破坏蛋白质分子表面的水化层使蛋白质溶解度降低，沉淀析出

1.4 按电荷分离的方法

1. SDS-PAGE 电泳 一个带有净电荷的分子会在电场中移动，蛋白质在高于或低于其 pI 的溶液中为带点颗粒，能在电场中移动

• SDS：变性剂，能破裂蛋白质分子中的氢键与疏水作用；使多肽链覆盖上相同密度的负电荷，掩盖了不同蛋白质间原有电荷的差别；改变蛋白质单体分子构象，去除了分子形状对迁移率的影响
• 巯基乙醇：打开二硫键
• 蛋白质在 PAGE 电泳的迁移率取决于它所带的净电荷、分子大小和形状等因素，而加入 SDS 和巯基乙醇后，其迁移率只与其相对分子质量有关，与电荷与分子形状无关

浓缩效应 【重点】

1. 凝胶层的不连续性：浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在浓缩胶中受阻力小，移动速度快
2. 缓冲液离子成分的不连续性：Gly 为慢离子，HCl 为快离子，蛋白质带浮点，有效迁移率介于两者之间

• 分子筛效应：大分子不能进入凝胶内部，先流出柱外，而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外，因此，混合样品得以因分子大小的不同而彼此分开
• 电荷效应：带电粒子在电场中受电场力作用而发生定向迁移，电荷符号决定迁移方向，电荷数量/表面电荷密度影响迁移速度
• PAGE 的特点：
  1. 具有分子筛效应，分辨率高
  2. 样品不易扩散，用量少
  3. 化学性质稳定
  4. 凝胶不带电荷，消除了电渗现象
  5. 机械强度好，有弹性
  6. 网孔可调节

2. 等电聚焦电泳 IEF 在 PAGE 中加入系列两性电解质载体，在电场中可形成一个连续而稳定的线性 pH 梯度，pH 从凝胶正极向负极依次递增，通过蛋白质 pI 的差异而分离

3. 双向电泳

• 第一向跑 IEF，通过 pI 分离
• 第二向跑 SDS-PAGE，通过分子量分离

4. 毛细管区带电泳 CZE

5. 毛细管凝胶电泳 CGE

6. 亲和毛细管电泳 ACE

7. 毛细管电动色谱 CEC

8. 离子交换层析 利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离，改变冲洗液的离子强度和 pH 值，物质就能依次从层析柱中分离

1.5 利用亲和性分离的方法

1. 亲和层析法 利用生物高分子具有能和某些对应的专一分子可逆结合的特性（配体 + 配基）

镍柱亲和层析

琼脂糖等载体上螯合了 Ni²⁺，而 His 标签（通常为 6×His）中的组氨酸咪唑侧链能与 Ni²⁺配位结合，使目标蛋白被吸附在柱上。

1.6 蛋白质的测定方法

⭐ 请移步至 [[01 食品分析与检验/FAI SP3 专题三：蛋白质分析|FAI SP3 专题三：蛋白质分析]]

2. 蛋白质结构分析

2.1 蛋白质一级结构分析

• 分离蛋白质样品必须纯（>97%）
• 巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，产生单一肽链

分析过程

1. 多肽链氨基酸和羧基端分析
2. 多肽链氨基酸组成分析
3. 多肽链有限水解为若干肽段

肽段氨基酸序列的测定

• Edman 化学降解法（苯异硫氰酸酯 PITC 法）：最初用于 N-端分析
• 酶降解法：利用肽链外切酶（外肽酶）分别从肽链两端向内切
• 质谱法：可以用串联质谱，也可以用气质联用来分析氨基酸序列

PITC 法

1. 多肽/氨基酸的 α-氨基能与 PITC （苯异硫氰酸酯，也称 Edman 试剂）反应，生成苯氨基硫甲酰多肽（PTC-多肽）
2. PTC-多肽在酸性有机溶剂中加热时，N-端的 PTC-氨基酸发生环化，其衍生物（PTH-氨基酸）从肽链上掉下来（PTC 基的引入只使第一个肽键的稳定性降低）
3. 除去 N-端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的
4. PTH-氨基酸可用于后续纯化鉴定
5. 可以重复使用 PITC，依次鉴定从 N-端脱下来的氨基酸，从而实现蛋白质的氨基酸序列测定

2.2 蛋白质空间结构分析

1. X 射线衍射晶体分析法

此方法需要先制备待测蛋白质的晶体

蛋白质结晶：当蛋白质溶液达到过饱和状态时，能形成一定大小的晶核，溶液中的分子失去自由运动的能量，不断结合到形成的晶核上

• X 射线本质是一种短波长、高能量的电磁波
• X 射线衍射现象利用 X 射线的波长和晶体中原子的大小及原子间距同数量级的特性来分析晶体结构
• 当 X 射线入射到样品晶体分子上时，分子上每个原子使 X 射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形

2. 核磁共振法 NMR

测量原子核对射频辐射的吸收

可用于确定水溶液中蛋白质分子的三维结构，还能显示蛋白质结构的动态变化（构象变化、蛋白质折叠、蛋白质与其他分子的相互作用）

NMR 局限性

要求被测样品是高纯度和高浓度的溶液，且相对分子质量不能太大

3. 圆二色谱法

可以通过测定蛋白质的圆二色性（CD）来计算 α-螺旋 及 β-折叠 的含量（蛋白质二级结构）

4. 红外光谱法

对蛋白质红外广谱中的酰胺谱带（α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲等）进行分析，测定蛋白质的二级结构

5. 生物信息学方法

同源建模法：任何两种蛋白质，如何两者序列的同源部分超过 30%，则它们具有相似的三维结构（基本折叠相同），因此借助计算机模拟来预测和构建蛋白质的三维结构

同源蛋白质

在不同生物体内行使相同或相似功能的蛋白质

折叠识别法：利用已知蛋白质的折叠子为模板，寻找给定氨基酸序列可能采取的折叠类型，进而进行结构预测

从头预测法：用计算机搜索算法寻找蛋白质结构能量最低值

2.3 功能分析方法

1. 酵母双杂交技术

• yeast two-hybrid system
• 一种利用酵母在体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的系统
• 真核转录因子由两个独立结构域组成
  • DNA 结合结构域 BD
  • 转录激活结构域 AD
• BD 与 AD 分开时不能激活转录。将诱饵蛋白 X 与 BD 融合，猎物蛋白 Y 与 AD 融合。若 X 与 Y 发生相互作用，BD 与 AD 被拉近，重建有功能的转录因子，激活下游报告基因（如 HIS3、ADE2、lacZ 等），从而被检测到。

[!QUESTION] 思考题

• 蛋白质结构分析方法有哪些？机制是什么？
• 蛋白质功能分析方法有哪些？机制是什么？

3. 案例：寻找蛋白质活性位点

大致思路

1. 找到一个空间区域
2. 找到其中关键残基
3. 判断哪些残基真正决定功能

Step 1. 获得蛋白质三维结构

• 实验结构：通过各种实验技术直接观察蛋白质空间结构
• AlphaFold 预测结构

Step 2. 从结构中寻找“口袋”

在蛋白结构中寻找：

• 凹槽
• 空腔
• 疏水口袋
• 带点区域

（这些地方可能是配体结合区域）

Step 3. 分析残基与配体的体相互作用

Step 4. 设计突变体

核心思想：通过改变某个残基的性质，观察蛋白质功能发生的变化

研究目的	突变策略
判断残基是否重要	Ala 扫描
去除正电荷	Arg/Lys ➡️ Ala
去除负电荷	Asp/Glu ➡️ Ala
改变电荷	Asp ➡️ Lys
去除芳香性	Phe ➡️ Ala

[!QUESTION] 开放性问题 请设计一个蛋白质活性位点的研究与突变体设计的实验