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微生物学 章节七：微生物的遗传与育种
#微生物学 #食品 #遗传 #育种 #基因工程 #菌种保藏 #实验技术
7.1 遗传的概念
遗传和变异是生物体最本质的属性
- 遗传 heredity：亲代将自身一整套遗传因子传给下一代的行为和功能，具有极其稳定的特性
- 变异 variation：生物体在某种外因或内因作用下引起的遗传物质结构或数量的改变
- 遗传型 genotype（基因型）：一个生物体所含有的基因的总和
- 表型 phenotype：一个生物体所具有的一切外表特征和内在特性的综合，是遗传型在合适环境条件下的具体体现，是一种现实性
- 基因型 + 环境条件 -> 表型
- 饰变 modification：指生物体由于非遗传因素引起的表型改变，这种改变不涉及遗传物质结构的改变，而是只发生在转录、转译水平上的表型变化
7.2 遗传变异的物质基础
- 质粒 plasmid：一类核外小型共价闭合环状dsDNA，以超螺旋状态存在于宿主细胞中，能独立于细胞核进行自主复制，可以通过交换掺入细胞核称为附加体，可以从宿主细胞中消除
- 跳跃基因 transposible element：在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段DNA序列
- 插入序列 insertion sequence，IS：分子量最小，只有引起转座的转座酶基因而不含其它基因，具有反向末端重复序列
- 转座子 transposon，Tn（转位子/易位子）：分子量适中，除了与转座作用有关的基因外，还含有抗性基因、乳糖发酵基因等几个至十几个基因
- Mu 噬菌体 mutator phage：即诱变噬菌体。Mu噬菌体引起的转座可以引起插入突变，其中约有2%是营养缺陷型突变
7.3 基因突变与育种
7.3.1 基因突变gene mutation
- 点突变
- 转换 transition
- 颠换 transversion
- 点突变类型
- 同义突变 same-sense mutation
- 错义突变 mis-sense mutation
- 无义突变 nonsense mutation
- 移码突变 frameshift mutation
- 多位点突变类型
- 缺失
- 插入
- 倒位
- 置换
- 重复
7.3.2 基因突变类型
- 营养缺陷型： 指微生物经基因突变引起的代谢障碍而必须添加某种营养物质才能正常生长的突变型
- 条件致死型
- 形态突变型
- 抗性突变型
- 产量突变型
- 其他突变型
7.3.3 突变率
- 定义：每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率
- 突变率 = 突变细胞数 / 分裂前群体细胞数
- 突变率是独立的
7.3.4 基因突变的特点
- 自发性和不对应性
- 自发突变概率低
- 独立性
- 稳定性
- 诱变性
- 可逆性
7.3.5 筛选营养缺陷型突变株培养基
- 与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体
| 不同遗传型个体 | 定义 | 符号 |
|---|---|---|
| 野生型 | 从自然界分离到的任何微生物在其发生营养缺陷突变前的原始菌株 | [A+B+] |
| 营养缺陷型 | 野生型菌株经诱变处理后，丧失了某酶的合成能力，只能在加有该酶合成产物的培养基中生长 | [A+B-] |
| 原养型 | 营养缺陷型突变经回复突变或重组后产生的菌株，营养要求在表型上与野生型相同 | [A+B+] |
- 与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基
| 培养基 | 英文翻译 | 特点 | 符号 |
|---|---|---|---|
| 基本培养基 | minimal medium，MM | 仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要的最低成分的组合培养基 | [-] |
| 完全培养基 | complete medium，CM | 凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的组合培养基 | [+] |
| 补充培养基 | supplemental medium，SM | 凡只能补充相应营养缺陷型菌株生长需要的组合培养基 | [A]/[B] |
7.3.6 基因突变的修复
- 光复活作用photoreactivation
- 经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下，可明显降低其死亡率
- 在进行紫外线诱变育种时，只能在红光下进行照射及处理照射后的菌液，且处理后要避光
- 切除修复（暗修复）
- 重组修复
- SOS修复
7.4 原核微生物基因重组
7.4.1 转化transformation
- 定义：指一个受体细胞吸收来自另一供体细胞的遗传物质，通过交换组合把它整合到自己的基因组中去，从而获得了后者某些遗传性状的现象
- 转化子：转化后的受体菌称为转化子
- 转化因子：供体菌的 DNA 片段称为转化因子
- 呈质粒状态的转化因子转化频率最高
- 受体细胞只有在感受态的情况下才能吸收转化因子
- 感受态：细胞能从环境中接受转化因子的这一生理状态，处于感受态的细胞称为感受态细胞
- 影响转化效率的因素
- 受体细胞的感受态决定转化因子能否被吸收进入受体细胞
- 受体细胞的限制酶系统和其他核酸酶决定转化因子在整合前是否被分解
- 受体和供体染色体的同源性决定了转化因子的整合
7.4.2 转导transduction
- 定义：以噬菌体为媒介，把一个菌株的遗传物质导入另一个菌株，并使这个菌株获得另一个菌株遗传性状
- 分类
- 普遍性转导： 转导型噬菌体能传递供体菌株任何基因
- 特异性转导：温和噬菌体侵染而形成的某一溶源细菌群被诱导裂解时，其中极少数个体的 DNA 可能与噬菌体的 DNA 发生若干特定基因转换，从而被整合到噬菌体的基因组上，当该噬菌体再次感染受体细胞时，就使受体细胞获得了这一特定遗传现象
- 转导颗粒：装有供体DNA片段的噬菌体
- 与转化的区分
| 基因重组的类型 | 区分 |
|---|---|
| 转化 | 一个受体细胞分裂会产生一个受体菌和一个转化子 |
| 转导 | 一个受体细胞分裂会产生两个转化子 |
7.4.3 接合
- F 质粒的类型
- F+：雄性，存在F质粒（F因子）
- Hfr：高频重组，F质粒整合在染色体组上
- F'：初生/次生，Hfr内F因子因不正常切割而脱离其染色体组
- F-：雌性，无F因子及相对应的性鞭毛
- 接合结果
- F+ + F- = F+ + F+
- F' + F- = F' + F'
- Hfr + F- = Hfr + Hfr 或 Hfr + F-
7.4.4 原生质体融合
- 定义：使用人为的方法使两个原生质体融合，使子代带有双亲的性状
- 方法
- PEG处理
- 电脉冲离心促融
7.5 自然选育
- 目的：选出维持原有生产水平或是具有更优良的高产菌株
- 原理：把微生物群体分离
- 步骤：
- 通过表现形态来淘汰不良菌株（初筛）：从菌落形态等可以直接观察到的形态特征来加以分析判断
- 通过目的代谢物产量的考察（复筛）：可以考察出菌种生产能力的稳定性和传代的稳定性，复筛条件应接近发酵生产工艺
- 进行遗传基因型纯度试验，考察菌种的纯度
- 传代稳定性试验：斜面传代3 - 5次。看产量是否稳定
7.6 诱变育种
- 优点：大大加快了菌种发生突变的频率和变异幅度，加快选育速度
- 基本过程：
- 选择合适的出发菌株
- 制备菌悬液
- 诱变
- 筛选
- 保藏和扩大试验
7.6.1 出发菌种的选择
- 出发菌株应具备
- 对诱变剂的敏感性高
- 具有特定生产性状的能力或潜力
- 出发菌株的来源
- 自然界直接分离到的野生型菌株
- 历经生产考验的菌株
- 已经历多次育种处理的菌株
7.6.2 制备细胞悬液的要求
- 浓度要求
- 真核细胞：10^6个
- 原核细胞：10^8个
- 对菌体的要求
- 菌体处于对数期且同步生长
- 细胞分散且为单细胞，避免表型延迟现象
7.6.3 表型延迟现象
- 概念：DNA突变后，其表型的改变在DNA复制和细胞分裂后才显现，致使菌株不纯
- 分离性延迟：变异细胞（Aa）不表现，子代纯合（aa）后表现
- 生理性延迟：子代纯合后（aa），细胞质中仍存在从母本中继承的非变异的蛋白或酶。随着不断繁殖，非变异蛋白或酶被稀释，新表型才出现
7.6.4 诱变处理
- 诱变剂的作用：
- 提高突变频率
- 扩大产量突变的幅度
- 诱变剂的合适剂量：凡在提高诱变率的基础上，能扩大变异幅度，促使变异移向正变范围的剂量（正变一般低剂量）
- 诱变剂种类的选择：
- 物理：紫外线（最简便）
- 化学：NTG（亚硝基胍）
- 紫外线诱变的剂量控制：
- 一定距离 30 cm
- 一定功率 15 W
- 只需控制时间就可以控制紫外线诱变的剂量
- 注意：全程在暗室中操作，达到预定时间后关闭紫外灯，在红灯下用黑纸包好进行增殖培养，以避免光复活作用
艾姆斯试验测定潜在化学致癌物
- 利用细菌的营养缺陷型变异菌株来检测环境或食品中是否存在“三致试剂”的简便方法
- 原理：营养缺型菌株在[-]平板上不能生长，如果此菌株接触化学试剂后接种到[-]平板能生长，则表明所接触的化学试剂具有诱变作用，因而表明该化学试剂为“三致”物
- 如在平板上无大量菌落产生，说明试样中不含诱变剂；如在纸片周围有抑菌圈，其外才是大量菌落，说明试样中某诱变剂的浓度很高；如在纸片周围即生长大量菌落，说明诱变剂的浓度合适
7.6.5 菌种的筛选
- 初筛：淘汰明显不符合要求的大部分菌株 以量为主，尽可能快速、简单
- 复筛：确认符合要求的菌株 以质为主，精确测定每个菌株生产指标
7.7 基因工程的基本操作
- 目的基因的取得
- 从供体细胞DNA中分离
- 通过反转录酶由mRNA合成cDNA
- 由化学方法合成特定功能的基因
- 基因载体的选择
- 目的基因与载体DNA的体外重组
- 重组载体引入受体细胞
7.8 菌种的衰退、复壮与保藏
- 衰退degeneration：微生物菌株在培养和保藏过程中由于自发突变的存在，优良性状劣化、遗传标记丢失
- 复壮rejuvenation：
- 狭义：衰退后重新筛选优良性状的菌株
- 广义：衰退前有意识地筛选纯种
7.8.1 防止菌种衰退的方法
- 控制传代次数
- 创造良好的培养条件
- 利用不易衰退的细胞进行接种传代
- 采用有效的菌种保藏方法
7.8.2 菌种复壮的方法
- 纯种分离
- 通过宿主体内生长进行复壮
- 淘汰已衰退的个体
7.8.3 菌种保藏的方法
- 生活态：传代培养保藏法
- 休眠态
- 湿法：
- 固体斜面
- 半固体琼脂柱
- 液体
- 干法：
- 藏在玻璃管内（小试管/安瓿瓶）
- 吸附在合适的载体上（沙砾/硅胶/曲料/滤纸片）
- 湿法：
7.9 基因工程
- 微生物多样性提供基因来源
- 基因工程的克隆载体有病毒、噬菌体和细菌质粒 DNA 改造而来
- 基因工程中用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化获得
- 大肠杆菌（pro）和酿酒酵母（pro）是基因工程中最重要的克隆载体宿主
- 利用工厂发酵实现大规模表达基因产物、构建工程菌
- 模式生物提供基础理论
7.9.1 基因工程的基本过程
- 获得目的基因
- 构建重组载体
- 将重组载体导入宿主细胞
- 筛选阳性重组子
- 基因测序与鉴定
- 基因的控制表达
- 获得表达产物/转基因动物/转基因植物
7.9.2 常见的基因工程宿主
- 大肠杆菌
- 最成熟，应用最广的原核表达宿主
- 无真核翻译后修饰
- 胞内存在 Lon、Glp 蛋白酶
- 酵母菌
- 真核表达系统
- 具备基础翻译后修饰
- 安全性好
- 表达量一般低于大肠杆菌
- 易引起人体免疫排斥
- 枯草芽孢杆菌
- 分泌能力强
- 自身分泌大量蛋白酶，容易降解目的蛋白
- 农杆菌
- 主要用于植物基因工程
- 乳酸菌
- 食品级
- 表达量偏低
- 毕赤酵母
- 强诱导型操纵子
- 重组蛋白分泌能力强，表达量高
- 能进行蛋白折叠与糖基化修饰
- 培养需要甲醇诱导
- 链霉菌
- 天然擅长合成抗生素、次级代谢产物
- 密码子偏好性特殊，生长周期长
7.9.3 大肠杆菌基因工程菌的构建策略
【本节是重点】
1） 包涵体型异源蛋白的表达
包涵体
大肠杆菌在某些生长条件下积累某种特殊的生物大分子，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒
形成包涵体的主要原因：表达量过高
包涵体形式表达蛋白的优缺点
- 能简化外源基因表达产物的分离操作
- 能在一定程度上保持表达产物的结构稳定
- 以包涵体形式表达的重组蛋白失去了原有的生物活性，必须通过有效的复性操作
2）分泌型异源蛋白的表达
分类
- 以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中
- 通过运输或分泌方式定位于细胞周至，甚至穿过内膜进入培养基中（胞外）
蛋白质分泌的前提条件：蛋白产物 N 段信号肽序列的存在
只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上，即可构建完全分泌型的受体细胞
分泌表达形式的优缺点
- 目的蛋白稳定性高
- 目的蛋白易于分离
- 目的蛋白末端完整
- 大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全，外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达
3）融合型异源蛋白的表达
将外源基因与受体菌自身的蛋白或外源蛋白编码基因拼接在一起，可表达的可溶蛋白、还能帮助正确折叠。这样的方式表达出的蛋白称为“融合蛋白”
通常受体细菌的蛋白部分位于 N 端，异源蛋白位于 C 端
融合型异源蛋白的表达的优缺点
- 目的蛋白稳定性高
- 目的蛋白易于分离
- 目的蛋白表达率高
- 目的蛋白溶解性好
- 目的蛋白需要回收
融合蛋白表达质粒的构建原则
- 受体细胞的结构基因能高效表达，且其产物可、通过亲和层析特异性简单纯化
- 外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游
- 尽可能避免融合蛋白分子中两种组分分子量过于接近
- 两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要
- 两个蛋白编码序列应保持一致的 ORF
回收目的蛋白的方法
- 化学裂解法（如溴化氰）
- 酶促裂解法
4）寡聚型异源蛋白的表达
将多拷贝的外源基因表达在一个低拷贝质粒上
寡聚型异源蛋白的表达的优缺点
- 目的蛋白高效表达
- 稳定表达小分子短肽
- 目的产物回收困难
5） 整合型异源蛋白的表达
- 转位因子依赖性体内重组
- 同源序列依赖性的体内重组
6） 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建
TIP
( ’ω’ ) 预祝复习顺利！！！