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微生物学 章节九：微生物的分类与鉴定
#微生物学 #食品 #分类 #命名
9.1 微生物分类学的概念、目的与任务
- 微生物分类学 （microbial taxonomy） ：按照微生物的亲缘关系将其安排成条理清楚的各种分类单元和分类群的科学
- 目的：把各种微生物按照它们的亲缘关系分群归类，排成系统，以便于人们对微生物进行鉴定和交流
- 任务
- 分类classification ：根据相似性或相关性将生物归属为类群或分类单元
- 鉴定identification ：给予分类类群单元与公布规则相符的名称，
- 命名nomenclature ：决定某一特定分离物归属于某一已确定分类单元的过程
9.2 生物分类法
9.2.1 三域学说
主要依据是 16S rRNA 和 18S rRNA 分类的
- 古生菌域
- 细菌域
- 真核生物域
9.2.2 分类原理
a）等级分类法
分类系统采用层次结构，从大到小依次为：界、门、纲、目、科、属、种。必要时可插入亚门、亚纲、总科等辅助阶元。
乳酸菌、益生菌这些名称不是生物分类学上的概念，而是人们按照其功能对特定菌种的通称
b）数值分类法
又称统计分类法，它不依赖演化假设，而是根据大量性状的总体相似性进行分类。认为“总体相似”比少数关键性状更能反映自然关系 将每个生物单元（如物种）用大量特征（如形态、生理等）编码为数据，计算两两之间的相似系数，再通过聚类分析构建树状图（表型图）
⚠️ 注意：数值分类获得的类群只能称表元，作为一种参考，而非一种生物学意义上的种属
c）化学分类法
依据微生物细胞的特征性化学组分对微生物进行分类的方法
1. CW 组分和全细胞糖型分类
利用细胞壁上的组分分类，主要用于放线菌门
2. 磷酸类脂分析
细胞膜上的极性类脂可作为鉴别属的特征
3. 枝菌酸分析
4. 脂肪酸甲基脂分析
全细胞甲基脂 GC 分析
5. 醌型分析
G+ 只含甲基萘醌
6. 红外光谱结构测定
9.2.3 分类特征
- 传统分类特征
- 数值分类特征
- 分子生物学特征
- 细胞化学结构特征
9.3 经典微生物鉴定
微生物鉴定经典鉴定指标大观
- 形态（个体、群体）
- 生理生化反应
- 生活特性
- 生活史，有性生殖情况
- 血清学反应（尤致病菌株）
- 对噬菌体敏感性
- 其他
9.3.1 形态特征
- 培养特征，如菌落形状、大小、颜色、隆起、表面状况、质地、色泽等
- 细胞形态，包括形态、大小、排列
- 特殊的细胞结构，包括鞭毛、芽孢、孢子、荚膜、超微结构等
- 细胞内含物，易染颗粒、聚β-羟丁酸等
- 染色反应，如革兰氏染色、抗酸染色、芽孢染色
- 运动性
常见染色反应的原理
- 革兰氏染色：依据细胞壁结构的差异。革兰氏阳性菌细胞壁肽聚糖层厚，脂质含量低，经结晶紫初染、碘液媒染、酒精脱色后仍保留紫色；革兰氏阴性菌细胞壁肽聚糖层薄，外膜脂质含量高，酒精脱色后紫色被洗脱，再经番红复染呈红色。
- 抗酸染色：主要用于分枝杆菌属等含大量脂质（分枝菌酸）的细菌。这类细菌细胞壁含大量脂质，普通染色难以着色，但一经着色后能抵抗盐酸酒精的脱色，故称抗酸菌。
- 芽孢染色：芽孢壁厚、透性低，普通染料难以进入，需用孔雀绿等染料加热染色，再用番红复染。
9.3.2 生理生化特征
- 营养类型
- 对 N 源的利用能力
- 对 C 源的利用能力
- 对生长因子的需要情况
- 需氧性，如好氧（如酵母菌）、微好氧、厌氧、兼性厌氧（如乳酸菌）
- 对温度的适应性
- 对 pH 的适应性
- 对渗透压的适应性
- 对抗生素及抑菌剂的敏感性
- 特征性代谢产物
- 与宿主的关系
微生物对 pH 和渗透压的适应性：复溶血嗜血菌
- 复溶血嗜血菌是一类海鲜中常见的致病菌，G-，因其对盐浓度的耐受性
- 我们吃海鲜喜欢蘸醋，一部分原因也是因其对酸性环境不耐受
9.3.3 血清学试验（血清型）
用于微生物分类鉴定，主要适用于抗原结构同源程度高的微生物种内血清型的分类鉴定，在流行病的研究中有重要意义
9.3.4 噬菌体敏感性（噬菌体型）
噬菌体对宿主的感染和裂解作用常具有高度的特异性。
⭐ 有关噬菌斑测定，详细请阅读：[[02 微生物学/MB 04 病毒#4.2.2 烈性噬菌体的增殖：一步生长|MB 04 病毒-烈性噬菌体的一步生长曲线]]
9.4 现代微生物鉴定
9.4.1 GC 摩尔比
【重点】
- 每一种生物都有一定碱基组成，亲缘关系近的生物，G+C % 含量应相似
- 不同生物之间 G+C % 差别大，表明其关系远
- 具有相似 G+C % 的生物并不一定表明它们之间具有相近的亲缘关系
笔者按：上面的三句屁话只是为了说明 G+C% 相似是亲缘关系近的必要不充分条件
G+C %的比较主要用于分类鉴定中的否定：
| 亲缘 | G+C % | 否定标准 |
|---|---|---|
| 同种 | 2.4-4% | G+C %若 >5%，则一定不同种 |
| 同属 | <10% | G+C %若 >15%，则一定不同属 |
测定 GC 摩尔比的方法
- 熔解温度 Tm 测定法： Tm 是 DNA 双链解链一半时所需的温度，与 GC 含量正相关。在变性过程中，DNA 双链解开成单链，260nm 处的紫外吸收值增加（增色效应）。通过增色效应测定 Tm 从而可以计算出 G+C %
- CsCl 浮力密度法：CsCl 密度高，且在超速离心中会自动形成密度梯度，可用于密度较高的分子（如 DNA）分离
9.4.2 核酸分子杂交
- DNA-DNA 杂交
- DNA-rRNA 杂交
- 核酸探针（特异性探针主要用于病原微生物的快速鉴定）
杂交同源性【要会判断】
| 杂交同源性 | 鉴定依据 |
|---|---|
| 20-60% | 同属不同种 |
| 60-70% | 同种 |
| >70% | 同一亚种 |
9.4.3 rRNA 寡核苷酸序列分析
通过分析细胞中最稳定的 rRNA 寡核苷酸序列同源性程度以确定不同生物间的亲缘关系
【重点】
原核细胞选择 16S rRNA 鉴定的原因：
- rRNA 普遍存在于原核生物和真核生物细胞中，故可用以比较它们在进化上的相互联系
- rRNA 有重要且恒定的生理功能
- 在细胞中含有大量的易提取的 rRNA
- rRNA 的基因在细胞中很稳定
- 16S rRNA 分子中某些碱基序列非常保守
- 16S rRNA 分子量适中，信息量大
9.4.4 商业化自动鉴定系统
- API 细菌数值鉴定系统
- Enterotube 系统
- “Biolog”全自动和手动细菌鉴定系统
9.4.5 蛋白质图谱分析
- 全细胞蛋白质电泳图谱分析
- 特定类群蛋白质电泳图谱分析
| 图谱 | 鉴定类目 |
|---|---|
| 核糖体蛋白图谱 | 放线菌分类 |
| 可溶性蛋白电泳图谱 | 真菌分类 |
9.4.6 蛋白氨基酸序列分析
9.4.7 质粒分析
将质粒从分离物中提取出来，在琼脂糖凝胶上进行分离电泳，检测其大小与数量 用限制性核酸内切酶消化质粒，比较酶切片段的大小
局限性
- 适用范围窄
- 有些质粒不稳定
- 纯化不纯容易与 DNA 混淆
9.4.8 RFLPs
DNA 的限制性片段长度多态性 restriction fragment length polymorphisms
限制酶消化 DNA 产生不同长度的 DNA 片段，电泳后通过合适探针进行杂交，观察结果（本质 southern blot）
9.4.9 PCR 技术
- RAPD，Random amplified polymorphic DNA，随机扩增 DNA 多态性
- AP-PCR，arbitrary primer-PCR，任意引物 PCR
- DAF，DNA amplification fingerprinting，DNA 扩增指纹
- AFLP，Amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性
AFLP
大致上就是在 RFLPs 的基础上进行修改，限制酶消化 DNA 产生不同长度的 DNA 片段后接上通用引物，PCR 扩增后再继续 southern blot，结合了 RFLP 技术的可靠性和 PCR 技术的高效性
9.5 生物的命名：双名法
- 学名 = 属名（首字母大写，斜体） + 种名（首字母小写，斜体） + （首名定名人） + 现名定名人 + 定名年份
- 需牢记的一些微生物学名
| 中文名 | 学名 |
|---|---|
| 大肠杆菌 | Escherichia coli |
| 枯草杆菌 | Bacillus subtilis |
| 金黄色葡萄球菌 | Staphylococcus aureus |
| 酵母 | Saccharomyces |
| 酿酒酵母菌 | Saccharomyces cerevisiae |
| 青霉菌属 | Penicillium |
| 根霉菌属 | Rhizopus |
| 毛霉菌 | Mucor |
9.6 系统发育树
TIP
( ’ω’ ) 预祝复习顺利！！！